Tolerancia al déficit hídrico en plantas basada en la regulación de la homeostasis del anión Cl- y el nivel de ploidía

Este proyecto pretende iniciar un abordaje multidisciplinar (fisiológico, genómico y molecular) sobre la caracterización de dos nuevos mecanismos, muy escasamente o nada conocidos, que mejoran la resistencia de las plantas al déficit hídrico a través de la optimización de la eficiencia del uso del agua. Estos mecanismos se fundamentan en: 1) La regulación de la homeostasis del anión Cl-; 2) el uso de plantas poliploides. Hemos observado que una reducción en la disponibilidad de agua induce en las plantas una mayor acumulación de Cl- y que una adecuada nutrición de este elemento mejora la resistencia al déficit hídrico en especies vegetales herbáceas y leñosas. Por otra parte hemos observado que las plantas tetraploides (o el uso de portainjertos tetraploides) incrementa la resistencia al déficit hídrico en relación a su parental diploide. Por último resultados preliminares indican que ambos fenómenos inciden en una reducción de la transpiración y en una mejora de la eficiencia del uso del agua. Pretendemos profundizar en el estudio fisiológico y molecular de estos fenómenos para poder trasladar los conocimientos resultantes a una mejora de la productividad agrícola. Para ello estudiaremos el efecto de la acumulación foliar de Cl- y del nivel de ploidía en el balance hídrico de la planta, en los perfiles hormonales, en los parámetros hídricos del tejido foliar, en la función de las células guarda y en la apertura estomática; caracterizaremos la expresión génica global asociada a la nutrición diferencial de Cl- y al nivel de ploidía; y abordaremos la caracterización molecular de transportadores, previamente identificados en nuestro laboratorio, que podrían estar regulando la homeostasis del Cl- en condiciones de déficit hídrico (genes NRT1-2, ICln y SLAH1). Aparte del uso de la planta modelo Arabidopsis thaliana en algunos objetivos moleculares, este proyecto contempla el uso de plantas más próximas a sistemas de cultivo, como el tabaco y los cítricos, en muchos de sus planteamientos experimentales. El interés de esta propuesta se fundamenta en su doble dimensión, por la novedad de la investigación en el ámbito de la biología vegetal (bases fisiológicas de la resistencia a estrés hídrico dependiente de dos mecanismos muy novedosos, expresión génica diferencial y regulación epigenética dependiente del nivel de ploidía, regulación molecular de la homeostasis de Cl-, etc.), y porque sus resultados pueden trasladarse a corto plazo a una mejora en la productividad agrícola. La formulación de fertilizantes que aseguren la adecuada disponibilidad de Cl- en el suelo y el uso de portainjertos tetraploides en cultivos frutales son claros ejemplos de acciones fácilmente derivables de este proyecto y que han despertado el interés de diversas empresas. La puesta en marcha de este proyecto implicaría además el reforzamiento y la dotación de recursos y de personal a un nuevo laboratorio y a una nueva línea de investigación en el Departamento de Biotecnología Vegetal del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla, donde el Dr. Colmenero acaba de iniciar sus actividades. La actual carencia de personal en el laboratorio del Dr. Colmenero limita el volumen del equipo investigador de este proyecto. Sin embargo hemos compensado esta deficiencia través diversas colaboraciones con investigadores de otros centros nacionales y extranjeros.

INTRODUCCIÓN

El déficit hídrico, es el principal factor que limita el desarrollo de las plantas terrestres, y se estima  hasta en un 70% su incidencia en pérdidas de rendimiento agrícola (Boyer, 1982), que son especialmente acusadas en regiones áridas o semiáridas como la península ibérica, dode este fenómeno se asocia frecuentemente a problemas de salinidad. Además, el cambio climático global predice una disminución de las precipitaciones a corto plazo en regiones como la nuestra (MacCrackken, 2008). Las plantas de interés agrícola son mesófitas en su gran mayoría, por lo que no pueden toleran procesos acusados (>30%) de deshidratación vegetativa. Sus mecanismos de tolerancia celular a la pérdida de agua son muy poco eficaces, por lo que en situaciones de sequía dependen principalmente de mecanismos de prevención del estrés hídrico o de prevención de la deshidratación celular (según nomenclatura definida por  Levitt, 1972 y por Verslues et al, 2006). Los mecanismos de prevención del estrés hídrico constituyen la primera respuesta de las plantas a la sequía y permiten regular el balance hídrico a través de minimizar la pérdida de agua por los estomas y optimizar su captura desde la raíz mediante la estimulación diferencial del crecimiento de la raíz y mediante la estimulación de la conductividad hídrica radicular (Kramer and Boyer, 1995). La finalidad de este proyecto es profundizar en el conocimiento de dos mecanismos, muy poco o nada conocidos que, de acuerdo a nuestros resultados previos, mejoran la resistencia de las plantas al déficit hídrico a través de una optimización en la eficiencia del uso del agua. Estos mecanismos se fundamentan en: i) la regulación de la homeostasis del anión Cl-; ii) en el uso de plantas y portainjertos poliploides. Se propondrán aproximaciones fisiológicas, genómicas y moleculares para abordar la caracterización de estos procesos.

 

Antecedentes y estado actual de los conocimientos científico-técnicos

 I) Homeostasis del anión Cl- y su relación con la aclimatación al déficit hídrico

La regulación del cierre estomático es un mecanismo esencial en la viabilidad de las plantas y por tanto está muy finamamente regulado por éstas a través de diversos estímulos. El déficit hídrico, por mediación de la fitohormona ácido abscísico (ABA), activa la salida masiva de aniones (Cl-, NO3-, malato) y de K+, y por tanto de agua, de las células guarda (Schroeder, 1989), reduciendo su turgencia y favoreciendo el cierre del estoma. Cuando estas respuestas no son suficientemente eficaces y comienza a reducirse el potencial hídrico (yw) de los tejidos vegetales, la supervivencia de las plantas depende de mecanismos que minimizan la deshidratación celular, a través principalmente del ajuste osmótico (Zhang et al, 1999), y de otros procesos como el endurecimiento de la pared celular (Kramer and Boyer, 1995; Verslues et al, 2006). El ajuste osmótico de las células vegetales se ha asociado fundamentalmente a la biosíntesis de moléculas orgánicas u osmolitos compatibles, que juegan tambien un papel esencial en la protección de macromoléculas y estructuras celulares frente a la deshidratación (Smirnoff, 1998). Pero existen detractores de la primacía de los osmolitos compatibles en el ajuste osmótico ya que frecuentemente no se ha podido establecer una correlación positiva entre ambos fenómenos (Bohnert and Shen, 1999), aparte de ser una respuesta lenta y costosa en términos metabólicos. A través de aproximaciones electrofisiológicas, algunos reportes han demostrado la participación directa de iones inorgánicos (K+, Na+ y Cl-) en el ajuste osmótico intracelular a corto plazo (Shabala y Lew, 2002; Shabala et al, 2000). A nivel de planta completa, la regulación del balance hídrico mediada por iones inorgánicos es un fenómeno muy poco conocido, tanto a nivel fisiológico como molecular. Se ha descrito mejor en la raíz, donde el ABA inhibe la descarga de iones K+ y Cl- al xilema, permitiendo su retención y, por tanto, una mayor eficacia en el ajuste osmótico de este órgano (Cram y Pitman, 1972), que es un requisito para estimular su crecimiento y poder así explorar un mayor volumen de suelo en busca de agua. En la regulación de este proceso a nivel del parénquima del xilema de la raíz, se ha demostrado la participación de canales de K+ (Roberts, 1998; Gaymard et al, 1998; Roberts y Snowman, 2000) y se ha sugerido la participación de canales de Cl- (Guilliham and Tester, 2005). Por tanto, los iones inorgánicos podrían estar participando en procesos de resistencia al estrés hídrico a diferentes niveles: i) favoreciendo la regulación del balance hídrico a través del cierre estomático y de la recuperación osmótica de la raíz; ii) promoviendo el ajuste osmótico intracelular para retener agua en situaciones en las que se está reduciendo el yw de los tejidos vegetales. En estos procesos siempre se ha reconocido la importancia del catión K+ como agente osmótico de primer orden, pero apenas se ha descrito la participación o esencialidad del anión Cl- y se desconocen los mecanismos moleculares implicados en su regulación.

Muy poco se ha avanzado respecto a la identificación y caracterización de genes y proteínas involucrados en transporte de Cl- en plantas. La atención se ha centrado fundamentalmente en la familia CLC de canales de Cl- dependientes de voltaje (Barbier-Brygoo et al, 2000; Geelen et al., 2000; Lurin et al, 1996; Hechenberger et al, 1996). Datos filogenéticos y funcionales han mostrado que los genes CLC de plantas codifican canales aniónicos y de transporte activo acoplado al gradiente de H+, presentes en compartimentos endosomales e involucrados en la compartimentalización de NO3- (De Angeli et al, 2006), en la regulación del pH en el sistema trans-golgi (Fecht-Bartenbach et al, 2007) y, posiblemente, en la compartimentalización vacuolar de Cl- (Wing-Yen et al, 2006). Sin embargo apenas se conocen los transportadores de Cl- de la membrana plasmática (MP), que serían los responsables de la entrada y/o salida de Cl- de las células vegetales, de su entrada al simplasto desde la raíz y de su transporte a larga distancia. Estudios fisiológicos muestran que en el rango micromolar, la toma de Cl- por la raíz está gobernada por cotransporte activo Cl-/H+ (Epstein, 1972; Lee, 1982) y se desconocen los genes involucrados. En el rango de baja afinidad tampoco se han identificado los mecanismos responsables. En estas condiciones la absorción neta de Cl- resulta de la combinación de transporte activo de entrada (simporte Cl-/H+; Felle, 1994) y de transporte pasivo de salida (mediado por canales), permitiendo un ajuste fino de su homeostasis celular (Britto y Kronzucker, 2006). El primer gen de un transportador activo de Cl- descrito en el reino vegetal, posiblemente involucrado en el transporte a larga distancia de este anión, es el Cotransportador Catión-Cl- de A. thaliana (AtCCC), identificado y caracterizado en nuestro laboratorio (Colmenero-Flores et al, 2007). Más recientemente se ha identificado el gen SLAC1, que codifica para el canal aniónico de la MP de células guarda y que regula el cierre estomático (Vahisalu et al, 2008; Negi et al, 2008). Otro miembro de esta familia, de función desconocida, AtSLAH1, se expresa en tejidos vasculares de la raíz de A. thaliana (Negi et al, 2008), pudiendo por tanto participar en el transporte a larga distancia de Cl-. Un reporte muy reciente también de nuestro laboratorio ha permitido identificar en cítricos mediante genómica funcional el gen CcNRT1-2 (Colmenero-Flores & Brumós et al, 2009) que, de acuerdo a ensayos preliminares de expresión funcional en la levadura Saccharomyces cerevisiae, podría tratarse del primer cotransportador H+/Cl- descrito en células vegetales, y estaría potencialmente involucrado en la toma de baja afinidad de Cl- (datos no publicados). Aparte de los ya citados, nuestro laboratorio ha identificado otros dos genes potencialmente involucrados en el transporte de Cl-, CcICln y CcSLAH1, que responden a déficit hídrico y/o ABA en raíces de cítricos.

El ión cloruro (Cl-) es un micronutriente esencial cuya importancia en las plantas se ha asociado a funciones celulares como la regulación de ciertas actividades enzimáticas, del potencial de la membrana plasmática, del pH intracelular y en procesos la transducción de señal. A su vez es un importante regulador osmótico y de la turgencia celular involucrado en la elongación celular y en la actividad de células motoras que participan en móvimientos násticos o, como hemos mencionado, en el propio movimiento estomático. Estas funciones, o al menos las más básicas para el adecuado desarrollo de las plantas, requieren de la presencia de Cl- en tejidos vegetales a una concentración propia de un micronutriente, en torno a 0.2-0.4 mg/g de peso seco (mg/g PS) (White and Broadley, 2001). Sin embargo se sabe que las plantas acumulan Cl- en sus hojas a niveles mucho más elevados cuando este elemento está disponible en el substrato. Esto se ha cuantificado en nuestro laboratorio, determinándose que en presencia de ~4 mM de Cl- en el medio, diversas especies vegetales llegan a acumular niveles de Cl- en sus tejidos foliares que exceden hasta en 3 órdenes de magnitud aquéllos requeridos como micronutriente (resultados no publicados). Por tratarse de un anión, la toma simplástica de Cl- desde la raíz a dichas concentraciones externas requiere de un transporte activo y, por tanto, controlado por la planta. En consecuencia, pensamos que dicho anión desempeña una función biológica como macronutriente que no ha sido claramente establecida. En sistemas animales el Cl- constituye un macronutriente esencial ampliamente estudiado por su función osmótica, en la regulación del balance hídrico y del volumen celular y por su relación con diversas enfermedades hereditarias. En las plantas ha recibido mucha menos atención a pesar de tratarse de un posible osmolito de cualidades excepcionales por ser abundante en la naturaleza, muy estable y tener mínimas interacciones covalente con moléculas orgánicas. El Cl- presenta además una propiedad físico-química anómala que podría tener relevancia biológica en este sentido, ya que la estabilidad de las interacciones entre las moléculas de agua presentes en su capa de solvatación es anormalmente elevada (Kropman and Bakker, 2001).

Estos antecedentes llevaron a nuestro laboratorio a realizar diversos experimentos dirigidos a estudiar si la acumulación de Cl- juega algún papel específico en la regulación del balance hídrico y en la tolerancia al déficit hídrico en plantas superiores. Encontramos claras evidencias (ver apartado 3.2) que sugieren que la acumulación de Cl- en hojas a niveles propios de un macronutriente, en mayor medida que otras moléculas como el NO3- o incluso el K+, constituye un mecanismo adaptativo empleado por las plantas para mejorar su resistencia al estrés hídrico (Fig.1). Esto tendría relevancia en múltiples prácticas agrícolas como por ejemplo el cultivo de los cítricos, la vid y otros frutales, a los que tradicionalmente se ha asociado el anión Cl- con toxicidad iónica (en un contexto de salinidad ambiental). Por ejemplo, actualmente se emplean fertilizantes especialmente formulados para no contener este anión y que, además, son más caros que los tradicionales.

Fig. 1 Plantas de tabaco sometidas a déficit hídrico, Las plantas N-5 y N-15 están sometidas a un suplemento 5mM (N-5) ó 15 mM (N-15) de sales de nitrato. Mientras que las plantas Cl-5 y Cl-15 están sometidas a un suplemento de 5mM (Cl-5) ó 15 mM (Cl-15) de sales de cloruro. El contenido foliar  de cationes acompañntes (K+, Ca++ y Mg++) es el mismo en todas las plantas (Brumós & Colmenero-Flores, no publicado)

II) Relación de la poliploidía con la aclimatación al déficit hídrico y su aplicación a los cítricos

Existen antecedentes en plantas sobre una mayor resistencia al déficit hídrico en genotipos poliploides en comparación con sus parentales diploides. Esto se ha podido determinar en germínulas de trigo (Franck, 1980), en plantas adultas de la misma especie (Xiong et al, 2006) y en plantas leñosas como el ciruelo o el abedul americano (Pustovoitova et al, 1996; Li et al, 1996). Este fenómeno podría aprovecharse en la agricultura mediante la sustitución de especies diploides (2n) por especies poliploides en regiones áridas o semiáridas, siempre que no se vea comprometida la calidad y/o productividad del cultivo. Otra opción contemplaría el uso de portainjertos poliploides de especies frutales sobre los que se injerten las variedades diploides de interés comercial, siempre que el beneficio de la resistencia al déficit hídrico dependa en mayor medida de la raíz que de los órganos aéreos. Esta aproximación la hemos aplicado recientemente con éxito en los cítricos, que constituye el cultivo frutal de mayor valor económico en España, donde ocupa una superficie aproximada de 305.000 hectáreas y una producción de unos 6,5 millones de toneladas  (Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, 2008). La sequía y la salinidad son las principales perturbaciones abióticas que limitan la productividad de los cítricos en España y otras regiones citrícolas mediterráneas, por lo que la capacidad de resistencia de los portainjertos ha sido objeto de frecuentes estudios (Levy and Syvertsen, 2004). El desarrollo vegetativo y reproductivo de los cítricos es muy sensible al déficit hídrico, que ve alterado severamente los parámetros de conductancia estomática, de intercambio gaseoso y de asimilación de CO2 (Gómez-Cadenas et al, 1996). Por tanto, en condiciones de estrés moderado puede afectarse la productividad de un cultivo de forma importante. Y si el déficit hídrico es severo o persistente, se verifican fenómenos de marchitamiento foliar y, de forma particularmente severa, de defoliación (Tudela y Primo-Millo, 1992). La inhibición del crecimiento y la activación de la abscisión foliar en cítricos se ha asociado a la actividad de las fitohormonas ABA (Takahashi et al, 1975) y etileno (Tudela y Primo-Millo, 1992). Se ha propuesto que ABA es la primera señal de respuesta al déficit hídrico y que ésta, a su vez, modula la síntesis y acumulación de etileno que, en último término provoca la abscisión foliar en los cítricos (Gómez-Cadenas et al, 1996).

La selección de un portainjerto adecuado en función a las característica edafológicas y climáticas del entorno tiene una importancia decisiva en el viabilidad de un cultivo de cítricos ya que determina el nivel de tolerancia a múltiples estreses bióticos y abióticos, así como a diversas deficiencias nutricionales como el hierro (Iglesias et al, 2007). Los portainjertos de cítricos se propagan asexualmente mediante el uso de semillas poliembriónicas como resultado de su naturaleza apomíctica. De forma espontánea, una proporción significativa de dicha descendencia clonal (entre un 1%-7%) es de naturaleza autotetraploide (4n) (Barrett y Hutchinson 1982, Saleh et al 2008). Este fenómeno ocurre por duplicación ocasional de la carga cromosómica de las células nucelares del óvulo materno (Cameron y Soost 1969), que son las que van a dar lugar a los embriones nucelares no cigóticos. En los viveros autorizados que propagan portainjertos de cítricos, las plántulas 4n pueden identificarse visualmente y son desechadas. Cuando se compara con plantas 2n, se observa que las hojas de las plantas poliploides se caracterizan por tener mayor número de cloroplasto y de contenido clorofílico (Warner et al, 1987; Mathura et al 2006), además de contener estomas de mayor tamaño y en menor densidad (Byrne et al 1981). Las plántulas de cítricos 4n crecen a una tasa menor que las 2n, lo que se ha asociado a una menor transpiración (Syvertsen et al 2000). Recientemente hemos observado que plantas 4n de diversos portainjertos comerciales de cítricos (naranjo trifoliado, carrizo Citrange y mandarino Cleopatra) son más tolerantes a la salinidad (Saleh et al, 2008) y a estrés hídrico (resultados no publicados) que sus parentales 2n (Fig. 2).

Fig. 2 Plantas de cítricos sometidas a déficit hídrico. En todos los casos la variedad injertada es Valencia nável diploide (2x). En las tres primeras macetas se empló el portainjerto lima Rangpur diploide (2x), mientras que en las tres últimas se emplearon descendientes autotetraploides (4x) del mismo portainjerto. Allario & Morillon (no publicado).

El proceso de poliploidización está frecuentemente asociado a modificaciones epigenéticas como los cambios en el patrón de metilación de citosinas o la activación de elementos transponibles (Osborn, 2003). También se han reportado fenómenos de remodelación genética causados por rearreglos del ADN, activación de genes, procesos de silenciamiento y pérdida de genes (Adams, 2005). Se ha propuesto que el incremento del número de copias de alelos y las modificaciones epigenéticas son factores que pueden mejorar la plasticidad genética de un organismo (Osborn et al, 2003), por lo que los genotipos 4n pueden ver mejorada su capacidad de adaptación a cambios ambientales y, por tanto a diversas condiciones de estrés respecto a los parentales 2n (Saleh et al, 2008). Se está comenzando a estudiar la expresión génica global asociada al fenómeno de poliploidía, y se ha propuesto que la duplicación génica ancestral se preserva en la evolución de una especie porque permite especializar parte de la dotación génica en procesos de respuesta y aclimatación a condiciones ambientales desfavorables (Liu y Adams, 2007).

IV) Grupos nacionales e internacionales afines

 1.     Transporte aniónico en el plano fisiológico: destacamos el grupo de S. K. Roberts de la Universidad de Lancaster (UK) que estudia transporte iónico (incluido aniones como citrato y Cl-) y ha descrito la regulación por estrés hídrico y ABA de canales de K+ del parénquima vascular. El grupo de de M. Tester de la Universidad de Adelaida (Australia) estudia principalmente transporte iónico (K+, Na+) en relación al estrés salino, pero también ha estudiado mecanismos de translocación de aniones (NO3-/Cl-) al xilema y su regulación por ABA. S. Shabala, de la Universidad de Tasmania (Australia) emplea técnicas electrofisiológicas para estudiar flujos de transporte iónico (principalmente K+, Ca++) en células vegetales y ha estudiado el ajuste osmótico en células vegetales a través de flujos de iones inorgánicos (incluido el Cl-) en respuesta a choque osmótico. El grupo de O. Pantoja (Universidad Nacional Autónoma de México) es también es un referente en el uso de técnicas electrofisiológicas aplicadas al transporte iónico (incluido el Cl-) en plantas, y colaborará con nuestro grupo a través de la expresión funcional en ovocitos de X. laevis de genes de plantas potencialmente involucrados en transporte de Cl-, así como en la determinación in vivo del potencial de membrana de células guarda. En relación al transporte iónico y la conductividad hídrica, destacaríamos a S. D. Tyerman, de la Universidad de Adelaida (Australia). E. Steudle de la Universidad de Bayreuth (Alemania) es un referente mundial en la medición de la conductividad hidráulica mediante el uso de la sonda de presión unicelular y nos ha ofrecido su asesoría a través de nuestra interacción con M Carvajal (Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura, Murcia) que ofrece su laboratorio y experiencia en el uso de dicha tecnología (ver carta anexa). R Morillon, miembro de este proyecto (IVIA) ha estudiado la actividad de las aquaporinas y la conductividad hídrica celular en relación al estrés hídrico y al ABA; C. Plieth (Universidad de Kiel, Alemania) por su contribución en el análisis del flujo de Cl- en plantas mediante el uso de sondas transgénicas fluorescentes. M. Talón (Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias) y V. Martínez (CEBAS, Murcia) poseen gran tradición en la fisiología del anión Cl- en relación con la sensibilidad al estés salino en cítricos. F. Rubio (Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura, Murcia), J. A. Fernández y M. J. García-Sánchez (Fac. Ciencias, Universidad de Málaga) son otros destacados investigadores nacionales en el ámbito de la electrofisiología. 

2.     Transporte aniónico en el plano molecular: K. Iba, de la Universidad de Kyushu, (Japón) J. Kangasjärvi (Universidad de Helsinki, Finlandia), y J. I. Schroeder (Universidad de California, EEUU) han identificado y caracterizado recientemente  el gen que codifica para el canal de aniones (SLAC-1) de células guarda involucrado en cierre estomático; C. Maurel (CNRS, Francia) y H. Barbier-Brygoo (CNRS, Francia) han participado decisivamente en la identificación y caracterización molecular de la familia CLC de plantas y más recientemente de los canales de agua o Aquaporinas, con los que trabajan actualmente en relación a la conductividad hídrica y la respuesta a estreses. En España, los investigadores más destacados en el área de transporte iónico y su regulación molecular se centran más en homeostasis de cationes (Na+, K+), principalmente en relación a la nutrición vegetal y el estrés salino: R. Serrano (Instituto de Biología Molecular de Plantas, Universidad Politécnica de Valencia/CSIC); A. Rodríguez-Navarro (Universidad Politécnica de Madrid), J. M. Pardo y J. Quintero (Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla, CSIC);  JP Donaire, A Belver, K Venema y P Rodríguez (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada).

3.     Uso de plantas poliploides:. J.F. Wendel (Iowa State University, EEUU), C. Osborn (University of Wisconsin, EEUU) han investigado evolución de alopoliploides y su expresión genómica. J.W. Grosser  y J.P Syvertsen (University of Florida, EEUU) han generado nuevas líneas alotetraploides (por hibridación entre parentales 2n) en cítricos y han estudiado su comportamiento fisiológico. F. Garcia-Sanchez y V. Martinez (CEBAS, CSIC, Muricia) en colaboración con el grupo de J.P Syvertsen, han investigado el uso de cítricos alotetraploides como posibles portainjertos resistentes a salinidad.

OBJETIVOS DEL PROYECTO

Nuestros datos (ver apartado siguiente) sugieren que la eficiencia del uso del agua en plantas superiores y, por tanto, su resistencia al déficit hídrico se puede optimizar a través de dos mecanismos muy escasamente caracterizados, como son la regulación de la homeostasis de Cl- a nivel subcelular y a nivel de planta completa, y mediante las alteraciones genéticas, epigenéticas, fisiológicas y anatómicas que distinguen a un genotipo multiploide respecto de su parental diploide. Esto nos han permitido proponer las siguiente hipótesis de partida:

I)          la acumulación de Cl- en hojas a niveles propios de un macronutriente constituye un mecanismo adaptativo empleado por las plantas para mejorar su resistencia al estrés hídrico a través de una regulación más estricta de la transpiración y de un ajuste osmótico más eficiente.

II)        El uso de portainjertos poliploides mejora la resistencia de las plantas al déficit hídrico a través, al menos, de una regulación más estricta de la transpiración.

Consideramos por tanto justificada esta propuesta: 1) porque esperamos resultados de elevado impacto científico en el ámbito de la biología vegetal dada la novedad de la investigación que planteamos y por los resultados positivos que ya hemos obtenido (ver a continuación); 2)  porque dichos conocimientos pueden trasladarse a corto plazo a una mejora en la productividad agrícola. La formulación de fertilizantes que aseguren la adecuada disponibilidad de Cl- en el suelo y el uso de portainjertos tetraploides en cultivos frutales son claros ejemplos de acciones fácilmente derivables de este proyecto y que han despertado el interés de diversas empresas.

Antecedentes y resultados previos

I) La acumulación de Cl- en hojas a niveles propios de un macronutriente constituye un mecanismo adaptativo empleado por las plantas para mejorar su resistencia al estrés hídrico. se fundamenta principalmente en datos obtenidos por el Dr. Colmenero, con la colaboración del Dr. Morillon:

 1.    Hemos cuantificado que en presencia de cantidades moderadas de Cl- en el medio (4,5 mM), diversas especies vegetales llegan a acumular niveles muy elevados de Cl- en sus tejidos foliares (~150 mg/gPS en variedades de cítricos tras 25 semanas de tratamiento; y ~40 mg/g PS en plantas de tabaco tras 8 semanas de tratamiento), lo que supera aproximadamente en 2-3 órdenes de magnitud sus requerimientos como micronutriente (resultados no publicados).

 2.    La acumulación de Cl- a niveles propios de de un macronutriente (en mayor medida que otras moléculas como el NO3- o el K+) desempeña funciones específicas en la regulación del balance hídrico y en la tolerancia al déficit hídrico en plantas superiores ya que hemos constatado que:

-     existe una correlación lineal entre el contenido de Cl- foliar y el grado de resistencia al déficit hídrico

-     las plantas tratadas con KCl son claramente más resistentes a déficit hídrico que las plantas tratadas con KNO3, a pesar de que el contenido de K+ es el mismo

-     las plantas que acumulan Cl- se desarrollan normalmente, pero transpiran menos que las plantas control

-     las plantas que sufren restricciones de agua inducen una mayor acumulación de Cl- en sus hojas, lo que indica que la toma de Cl- está regulada por a planta en base al nivel de disponibilidad hídrica

-     Tratamientos exógenos de ABA movilizan las reservas foliares de Cl- hacia la raíz

3.    Dado nuestro interés en la homeostasis de Cl- en el contexto del estrés salino e hídrico, durante el desarrollo de mi actividad investigadora en el IVIA (Valencia) iniciamos aproximaciones filogenéticas y genómicas para identificar transportadores de Cl- en plantas superiores, y constatamos que algunos de los genes identificados se regulan por estrés hídrico y/o ABA:

-     Por homología a los “Cation-Cl- Cotransporters” animales (CCCs), pudimos identificar y caracterizar funcionalmente en plantas los genes ortólogos de cítricos y Arabidopsis (AtCCC, CcCCC) (Colmenero-Flores et al, 2007).

-     Por una aproximación genómico-funcional, hemos identificado un transportador de la familia “Proton-dependent Oligopeptide Transporter” (POT) de cítricos CcNRT1-2 (Brumós & Colmenero-Flores et al, 2009). La expresión funcional de CcNRT1-2 en en S. cerevisiae estimula la captación celular de Cl-. Este gen se induce en la raíz por ABA y por ayuno de Cl- (no publicado).

-     Por homología a los “Nucleotide-sensitive Chloride Conductance Regulator” (ICln) de animales, hemos identificado y clonado el gen ortólogo CcICln de cítricos. En células animales la proteína citoplásmica ICln migra a la MP en respuesta un incremento del volumen celular producido por un choque hipo-osmótico, donde media o transactiva la salida de iones inorgánicos (incluido el Cl-), favoreciendo la salida de agua y la recuperación del volumen celular normal. Hemos comprobado que el gen CcICln de cítricos se reprime fuertemente en la raíz por déficit hídrico y por aporte de Cl- (no publicado).

-     Por homología con AtSLAC1 de Arabidopsis thaliana (que codifica para el canal aniónico de la MP de células guarda y que regula el cierre estomático) y con AtSLAH1, otro miembro de la misma familia de de función desconocida y que se expresa en tejidos vasculares de la raíz, hemos identificado y clonado el gen CcSLAH1. Este gen se induce por ABA en raíces de cítricos (no publicado). 

4.    Mediante ensayos fisiológicos con portainjertos de cítricos en medio hidropónico, pudimos constatar que un nivel importante de regulación de la homeostasis de Cl- en las plantas se verifica a través de la regulación de su traslocación al xilema (manuscrito en preparación; revisado en Tadeo et al, 2008).

II) El uso de portainjertos poliploides mejora la resistencia de las plantas al déficit hídrico. Se fundamenta principalmente en datos obtenidos en el laboratorio del Dr. Morillon, con la colaboración Dr. Colmenero. Hemos observado recientemente que plántulas 4n de los cítricos Poncirus tripholiata, citrange Carrizo y mandarino Cleopatra son más tolerantes a un estrés salino moderado en comparación con sus respectivos parentales 2n (Saleh et al, 2008). Recientemente hemos verificado también que plántulas de la lima Rangpur 4n son mucho más resistente al déficit hídrico respecto al parental 2n. Pero lo que aún resultó más interesante fue constatar que una planta con un portainjerto 4n mantiene la resistencia a déficit hídrico aún cuando la variedad injertada es 2n. Así, cuando la plántula de la lima Rangpur (LR) se empleó como portainjerto de la variedad Valencia delta (VD) 2n, los plantones LR-4n/VD-2n seguían siendo claramente más resistentes a déficit hídrico que los plantones LR-2n/VD-2n. Ensayos fisiológicos realizados a dichas plantas mostraron que las plántulas 4n transpiraban menos que las 2n. Esto también se observó en plantones donde se usa una variedad 2n injertada en un portainjerto 4n. También observamos que en condiciones control (en plántulas bien irrigadas) la tasa de transpiración del genotipo 4n era menor que la del parental 2n tanto en plántulas 4n completas como en plantones injertados LR-4n/VD-2n. Concluimos por tanto que la resistencia a déficit hídrico en plantas 4n se debe total o parcialmente a la reducción de la transpiración, y que dicha reducción está regulada por un mecanismo de señalización dirigido desde la raíz. La línea de investigación iniciada por el Dr. Morillon sugiere fuertemente que el uso de genotipos poliploides puede aportar una nueva fuente de portainjertos a la citricultura con mejor capacidad de aclimatatación a las condiciones ambientales propias de la cuenca del Mediterráneo.

Objetivos concretos

1.       Estudio del efecto de la acumulación foliar de Cl- y del nivel de ploidía en el balance hídrico de la planta: bases fisiológicas. Se tratará de identificar los mecanismos fisiológicos asociados a la acumulación de Cl- que sean responsables del incremento en la resistencia a déficit hídrico. Los parámetros a estudiar, en plantas control y estresadas sometidas a diferente nutrición de Cl- serán: el desarrollo relativo de la raíz respecto a la región aérea; potenciales hídrico, osmótico y de turgencia del tejido foliar; contenido iónico; contenido de ABA; tasa de transpiración, eficiencia fotosintética y WUE.

2.       Estudio del efecto de la acumulación foliar de Cl- y del nivel de ploidía en la conductividad hidráulica celular y en la función estomática: bases celulares. Para dilucidar las causas de la regulación de la apertura estomática dependiente del contenido de Cl-, se analizarán los parámetros hídricos y eléctricos a nivel celular. Se determinarán los valores de turgencia de células guarda, células auxiliares adyacentes y otras células epidérmicas, así como los valores de los potenciales eléctricos de MP de células guarda y ptras células epidérmicas. Se estudiará si estos fenómenos producen alteraciones en la actividad de las aquaporinas que puedan explicar modificaciones en la conductividad hídrica de las células del mesófilo y de las células guarda. 

3.       Efecto de la nutrición de Cl- y del nivel de ploidía en la expresión génica global: bases genómicas. Mediante genómica funcional, se analizará la expresión génica global asociada a los factores que son objeto de estudio en este proyecto. Se analizarán los transcriptomas de raíces de Arabidopsis thaliana asociados a modificaciones en el estado nutricional del anión Cl- para identificar los componentes moleculares que participan en la regulación de su homeostasis. Se analizarán también los transcriptomas de raíces y hojas de cítricos asociados al nivel de ploidía. Se contemplará un análisis multifactorial (control, sequía) x (2n, 4n) tanto en individuos uniformes como en individuos injertados según el esquema (portainjerto-4n / variedad injertada-2n respecto a portainjerto-2n / variedad injertada-2n). Se testará mediante “bisulfite PCR Single Strand Conformation Polymorphism” (SSCP) si posibles cambios de expresión génica entre plantas 2n y 4n se deben a regulación epigenética como la modificación de patrones de metilación. 

4.       Caracterización funcional de genes potencialmente involucrados en la homeostasis de Cl-: bases moleculares. Se avanzará en la caracterización funcional de los genes NRT1-2, ICln y SLAH1 identificados en nuestro laboratorio y se determinará su posible  implicación en la regulación de la homeostasis de Cl-, especialmente en respuesta a estrés hídrico. Estudiaremos los patrones de expresión de los genes en portainjertos de cítricos con capacidad contrastada para excluir Cl- en condiciones control y en respuesta a déficit hídrico; realizaremos la expresión funcional de estos genes en ovocitos de Xenopus laevis para determinar su actividad; nos aproximaremos a su función biológica mediante el análisis de líneas mutantes de Arabidopsis thaliana y mediante la localización subcelular y tejido-específica de sus productos. 

 

Novedades: respecto a los objetivos 1 y 2, apenas existen antecedentes que relacionen la regulación del balance hídrico de la planta con los fenómenos analizados en esta propuesta. El objetivo también 3 es muy novedoso. Se han desarrollado aproximaciones genómicas en relación a la nutrición mineral, pero nunca con Cl-. Tampoco existen precedentes sobre estudios de genómica-funcional o de regulación epigenética  aplicados al estudio de la poliploidía en cítricos. El objetivo 4 aborda la caracterización de genes de función desconocida en el reino vegetal.

 Relevancia: estos resultados proporcionarán nuevos parámetros (y sencillos de aplicar) que permitirían mejorar el nivel de resistencia de los cultivos al déficit hídrico (ej: uso de fertilizantes con niveles variables de Cl- en base a su disponibilidad en el suelo o el uso de portainjertos poliploides). La relevancia de los objetivos propuestos también se fundamenta en el impacto científico que esperamos de la descripción de fenómenos escasamente (o nada) caracterizados en el ámbito de la biología vegetal.

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Beneficios socioeconómicos potenciales del proyecto

El déficit hídrico se encuentra entre los principales problemas medioambientales de España, con un clima que se caracteriza por la irregularidad espacial y temporal e las precipitaciones (de los últimos 80 años, 32 han sido secos o muy secos). Resulta especialmente grave la constatación de que el déficit hídrico mantiene una tendencia al agravamiento en nuestro país (Resolución B6-0308/2005 del Parlamento Europeo sobre las consecuencias de la sequía en España), posiblemente por efecto del cambio climático global. Así, en el último decenio se han medido algunos de los peores datos pluviométricos desde que se tienen registros (Instituto Nacional de Meteorología), lo que ha tenido repercusiones socioeconómicas muy negativas, principalmente en relación al sector agrario y al desarrollo rural. Según la agencia Nacional del Agua, en España se está pagando un tercio del valor real del agua, estimándose que a partir del 2010 empezarán a subir los precios de la misma. Ante esta nueva situación, muchas administraciones públicas han tratado de dar respuestas con medidas que permitan mantener la rentabilidad del sistema de producción agraria dentro de un equilibrio con el medio y los recursos disponibles, y que contribuya a la implantación de una agricultura sostenible. Los mecanismos moleculares y fisiológicos que en la práctica distinguen a variedades agrícolas resistentes a déficit hídrico residen fundamentalmente en factores de prevención del estrés, capaces de mejorar la eficiencia del uso del agua en la planta (Chaves y Oliveira, 2004). Sin embargo la biología molecular se ha volcado más en la caracterización de factores de tolerancia celular a la deshidratación, de enorme interés científico, pero más alejados de los mecanismos que en la práctica pueden mejorar el rendimiento de los cultivos. Este proyecto aborda la caracterización de dos mecanismos muy poco conocidos que pueden mejorar claramente la eficiencia del uso del agua en las plantas y, como ya hemos comprobado, su resistencia al déficit hídrico. Además, dichos mecanismos podrán trasladarse a la agricultura a muy corto plazo con aproximaciones tan sencillas como la reformulación de fertilizantes y el uso de portainjertos poliploides, lo que ha suscitado el interés de diversas empresas (ver abajo).

 Avances científico-técnicos

Otra cualidad de esta propuesta es la de estudiar procesos fisiológicos y moleculares muy poco conocidos o muy poco estudiados en otros laboratorios. Esto facilita la generación de nuevo conocimiento con buenas perspectivas de impacto. Por ejemplo recientemente hemos publicado el primer carrier de Cl- descrito en plantas (Colmenero-Flores et al. 2007, Plant J 50: 278-292), y en este proyecto planteamos la caracterización de otros 3 genes de función desconocida potencialmente involucrados en la homeostasis de Cl-. Los conceptos de una regulación de la homeostasis de Cl- en función a la disponibilidad hídrica y el de una mayor resistencia al déficit hídrico como consecuencia directa de una mayor acumulación de Cl- son nuevos y esperamos que adquieran gran relevancia en la biología vegetal. Todo lo dicho se puede aplicar también a las propiedades de las plantas tetraploides y su posible aplicación en la mejora de la resistencia de los cultivos al déficit hídrico.

 

Contribuciones científico-técnicas y difusión de los resultados

La divulgación académica de los resultados se conseguirá a través de publicaciones en revistas internacionales especializadas y de la asistencia a congresos del área. Esperamos los siguientes bloques de resultados que pretendemos publicar a mediano plazo:

1)       La toma de Cl- por las plantas regulada en base a la disponibilidad hídrica y su función adaptativa en la resistencia a estrés hídrico, así como la identificación (parcial o total) de las bases fisiológicas y celulares que expliquen el fenómeno.

2)       La mayor resistencia a déficit hídrico en cítricos autotetraploides, así como la identificación (parcial o total) de las bases fisiológicas y celulares que explican el fenómeno e identificación de los mecanismos que regulan diferencialmente el funcionamiento estomático en plantas 4n.

3)       Genómica funcional de la homeostasis de Cl-.

4)       Comparación de los transcriptomas 2n y 4n en condiciones control y en plantas sometidas a déficit hídrico.

5)       Al menos uno de los genes cuya caracterización funcional se aborda en esta propuesta.

Transferencia a empresas

Los resultados obtenidos en el transcurso del proyecto que sean susceptibles de ser transferidos a sectores productivos se pondrán en conocimiento de la Oficina de Transferencia de Tecnología del CSIC para conseguir la máxima difusión entre los sectores socio-económicos potencialmente interesados. Respecto a las empresas interesadas en este proyecto, pretendemos transferir principalmente los conocimientos derivados de los objetivos 1 y 2. A partir del segundo año, se podrán sentar las bases para solicitar proyectos de investigación orientada a la transmisión del conocimiento a la empresa (TRACE) con estas EPOs:

-     Viveros Sevilla: 1) regulación de los niveles de Cl- en la solución de fertirrigación empleada en su sistema de producción de portainjertos y plantones de cítricos en contenedores bajo invernadero; 2) Valoración del uso de portainjertos 4n de cítricos y olivo.

-     Fertinagro: Formulación de nuevos fertilizantes con niveles dinámicos de Cl- adaptables a las características del suelo

-     BioAvan I+D+IAplicación de los resultados al desarrollo de nuevas tecnologías, gestión de posibles patentes.