Estudio de biomarcadores de toxicidad en microalgas marinas como herramienta para la detección precoz de procesos de contaminación (PHYTOBIOMARK).

Las referencias acerca del uso de biomarcadores de toxicidad en poblaciones de microalgas son muy escasas, sobre todo en el ámbito de los ecosistemas marinos

(incluidos los ecosistemas costeros, estuáricos y agua intersticial de sedimentos). Sin

embargo, los organismos del fitoplancton tienen una gran importancia, tanto desde el

punto de vista trófico (conforman la base de la cadena alimentaria en esos ecosistemas) como por su relación con los ciclos biogeoquímicos de las sustancias

potencialmente contaminantes presentes en dichos biotopos y con los posibles procesos

de bioacumulación y biomagnificación de estas sustancias, debido a la alta capacidad

de las microalgas para acumularlas en distintos compartimentos celulares.

El proyecto que se presenta a continuación propone el estudio del uso de biomarcadores de toxicidad, tanto moleculares (glutatión, fitoquelatinas, proteínas

de estrés térmico -HSPs-, especies reactivas del oxígeno -ROS-) como enzimáticos

(superóxido dismutasa -SOD-, catalasa -CAT-, ascorbato peroxidasa -APX-,

Glutatión reductasa -GR- y glutatión-S-transferasa -GST-) sobre poblaciones

microalgales, bien establecidas desde líneas celulares en el laboratorio, bien provenientes de poblaciones mixtas recolectadas en medios naturales, como respuesta precoz ante la presencia de diversos contaminantes-tipo: metales, herbicidas y sustancias anti-fouling.

El proyecto contempla, asimismo, el diseño de un “set” de medida de toxicidad para ambientes marinos, costeros, estuáricos y agua intersticial de sedimentos, basado en la respuesta de microalgas ante potenciales sustancias tóxicas, susceptible de ser utilizado por personas no adiestradas en el manejo de poblaciones microalgales y con las características necesarias para ser patentado y comercializado.

INTRODUCCIÓN

Los océanos se han considerado, desde el inicio de la era industrial, como un vertedero ilimitado para depositar de forma segura los contaminantes potenciales que la actividad humana, de manera creciente con los años, ha ido generando. Hoy en día se reconoce el efecto nocivo de muchas de estas sustancias sobre los ecosistemas marinos (incluso cuando tales sustancias se encuentren todavía en bajas concentraciones en los océanos) y la necesidad de monitorizar los efectos y, en su caso, regular los aportes al mar de dichas sustancias. Casi la mitad de la fotosíntesis del planeta se lleva a cabo en el medio marino (Falkowski, 1980). En estos ecosistemas (oceánicos, costeros y estuáricos) la producción primaria de las microalgas conforma la base de la cadena trófica. La monitorización del impacto de potenciales contaminantes sobre estos organismos es compleja, dadas las diferentes sensibilidades de distintos organismos frente a una misma sustancia xenobiótica y las dificultades que implican ensayos que traten de reconocer los efectos crónicos de los contaminantes persistentes sobre las poblaciones microalgales (Torres et al., 2008).

Sin embargo, las microalgas marinas pueden ser especies indicadoras útiles dadas sus

características celulares y su papel en las redes tróficas marinas, a saber: su pequeño tamaño (que implica una relación superficie / volumen muy alta), su capacidad de acumulación de algunas sustancias xenobióticas, y su posición basal en la cadena trófica, que incrementa el riesgo de procesos de biomagnificación a lo largo de la misma. Por una parte, la presencia de microalgas puede implicar, dada la capacidad de estos organismos para acumular potenciales contaminantes, una reducción de la concentración de dichas sustancias en el medio, beneficiando a las especies que no se alimentan de ellas. Por otra, la citada capacidad de acumulación de tóxicos podría facilitar la absorción de estos contaminantes (y, por tanto, incrementar su toxicidad) para los organismos que sí se alimentan de ellas, así como par el resto de subsecuentes depredadores en la cadena alimentaria (Torres et al., 2008). Algunos grupos taxonómicos microalgales (por ejemplo, los cocolitofóridos), representan un papel

clave en los ciclos biogeoquímicos marinos, al estar involucrados en el transporte de diversas especies químicas desde la columna de agua al sedimento (Vargas et al., 2007).

Por todo ello, a pesar de que tradicionalmente se han utilizado muchos animales en programas de biomonitorización de procesos de contaminación marina, existe una tendencia creciente hacia la inclusión de organismos fotosintéticos entre los organismos utilizados como monitores de sustancias xenobióticas en medios marinos (Volterra & Conti, 2000; Barreiro et al., 2002; Conti et al., 2007).

Un biomarcador se define como una respuesta biológica a uno o varias sustancias químicas que da una medida de la exposición y, a veces, del efecto tóxico que produce (Peakall, 1994). Las microalgas presentan diferentes métodos de defensa contra la contaminación provocada por sustancias xenobióticas. Algunas de ellas implican el bombeo activo de estas sustancias fuera de la célula (Maeda & Sakaguchi, 1990). En otras ocasiones, las células algales producen moléculas específicas o incrementan determinadas actividades enzimáticas como respuesta ante situaciones de estrés provocadas por la presencia de sustancias que les resultan tóxicas.

Este proyecto plantea el estudio de estos mecanismos de respuesta por parte de las microalgas ante la presencia de determinadas sustancias tóxicas, el uso de la medida de tales respuestas como biomarcadores de la calidad medioambiental de ecosistemas marinos, costeros y estuáricos y el estudio de la relación entre la expresión de estos biomarcadores con la evolución de las poblaciones microalgales estudiadas.

La concentración de glutatión (tripéptido involucrado en procesos de detoxificación frente a la contaminación por metales), así como la de metalotioneínas intracelulares (concretamente del tipo III, denominadas específicamente fitoquelatinas) han sido utilizadas recientemente en microalgas como biomarcadores de toxicidad (Kawakami et al., 2006a, b; Li et al., 2006; Morelli, et al., 2008; Pérez-Rama 2001; Sanità di Troppi, 2008), si bien su uso se ha restringido a pocas especies microalgales. Las heat shock proteins (HSPs) conforman una familia de proteínas de diverso peso molecular, cuya concentración intracelular se incrementa ante situaciones de estrés. Estas proteínas han sido estudiadas en muy pocas especies microalgales, concretamente en un fotobionte de un liquen (Backor et al., 2006) y en Isochrysis galbana (Wolfe et al., 1999), aunque muy probablemente se hallen presentes en todas las clases taxonómicas algales, al tratarse de proteínas muy conservadas (Torres et al., 2008).

Frente al incremento de las concentraciones de las especies reactivas del oxígeno (ROS),

responsables del estrés oxidativo, también las enzimas que combaten dicho estrés incrementan su actividad y concentración. Estas moléculas específicas y la actividad de las enzimas citadas pueden utilizarse como biomarcadores precoces de toxicidad. La actividad de algunas de estas enzimas, tales como la catalasa, la superóxido dismutasa, y las enzimas relacionadas con el glutatión (glutatión reductasa, glutatión peroxidasa, glutatión-Stransferasa) han sido recientemente estudiadas en algunas especies microalgales dulceacuícolas (Dewez et al., 2005) y marinas (Li et al., 2006), como marcadores de estrés para sustancias xenobóticas que no producían, a corto plazo, un efecto detectable en otros biomarcadores más frecuentemente utilizados, tales como la fotosíntesis o el quenching fotoquímico. Estos biomarcadores también han demostrado ser más efectivos y fiables que otros enfocados hacia la viabilidad celular, tales como el diacetato de fluoresceína (FDA) (Labra et al., 2007). Además, los biomarcadores citados cuentan con la ventaja de presentar respuestas mucho más rápidas que los tradicionales bioensayos basados en el crecimiento de las poblaciones (Torres et al., 2008): los procesos de defensa de las células microalgales ante la presencia de concentraciones subletales de tóxicos se activan de manera mucho más rápida (en menos de 24 h) que los efectos que pueden medirse sobre las poblaciones microalgales (Gallego et al., 2007).

Así, la finalidad del proyecto es el estudio de los mecanismos intracelulares de defensa por parte de las microalgas marinas ante situaciones de estrés tóxico, así como el uso de estos procesos como biomarcadores de estrés, con objeto de utilizar este conocimiento en sistemas de alerta precoz ante posibles procesos de contaminación.

Los xenobióticos elegidos para realizar los experimentos que se proponen en esta memoria de investigación son algunos metales de relevancia ecológica en los procesos de contaminación costeros (Cu, Cd, Zn, Pb) y otros contaminantes orgánicos (preferentemente herbicidas y sustancias antifouling (Atrazina, Linuron, Diuron, Irgarol) cuyas concentraciones en estuarios y ecosistemas costeros pueden alcanzar valores medioambientalmente relevantes. Documentos recientes reconocen la peligrosidad de algunos metales, tales como los enumerados en esta memoria, en procesos de contaminación costera, así como el papel clave de las microalgas como organismos susceptibles de sufrir sus efectos, y la importancia de la microflora en procesos de bioacumulación y posible biomagnificación a lo largo de la cadena trófica (Amiard-Triquet et al., 2006; Fairbrother et al., 2007; Lamelas et al., 2007; Burger,

2008). El incremento del uso de distintos contaminantes orgánicos, tales como los herbicidas y pinturas anti-fouling, implica un potencial daño a las poblaciones fitoplanctónicas y microfitobénticas, cuyo alcance aún no ha sido dilucidado. Estudios muy recientes sobre poblaciones microfitobénticas de ríos (Debenest et al., 2008) han demostrado que la presencia de ciertos herbicidas provocan anormalidades en los frústulos de las diatomeas, así como aberraciones en los núcleos de estas células (localización anormal de los mismos, formación de micronúcleos, células multinucleadas y disgregación de la carioteca). Otros herbicidas afectan negativamente, aún a concentraciones bajas, a poblaciones experimentales de microalgas dulceacuícolas (Dewez et al., 2008).

Así, hasta el momento, los trabajos previos referidos al estudio de estos biomarcadores en microalgas son escasos y dispersos, y la inmensa mayoría de los trabajos publicados aluden a especies microalgales dulceacuícolas. Algunos grupos extranjeros centran su actividad en el estudio de los efectos de los contaminantes citados sobre microalgas de ambientes no marinos: Li y colaboradores (2005), de la Universidad Central de China de Wuhan, estudiaron el efecto de un pesticida (cipermethrin), efectivo contra pequeños crustáceos, sobre biomarcadores medidos en poblaciones microalgales de la especie Scenedesmus obliquus, uno de los organismos estándar en ecotoxicología de agua dulce, comprobando que la actividad superóxido dismutasa (SOD) era un biomarcador muy sensible a la hora de detectar respuestas de las poblaciones experimentales ante el xenobiótico ensayado. Estos autores argumentan que la respuesta más temprana de este biomarcador (frente a otros tales como el crecimiento de la población) se debe a que la respuesta molecular de las células frente al estrés es mucho más rápida que los efectos sobre la población, que implican la división de las células. Otro grupo de investigación chino, de la Universidad de Nanjin, estudiaron las respuestas de esta misma enzima (SOD) y otras dos más (catalasa -CAT- y glutation peroxidasa -GPX-) ante el estrés provocado por diferentes concentraciones de Cu y Zn sobre la microalga marina Pavlova viridis, constatando asimismo un incremento en la peroxidación lipídica de las

células expuestas. Estos autores reconocen una respuesta diferente de las enzimas estudiadas ante ambos metales (Li et al., 2006). En un artículo muy reciente, Morelli y colaboradores (2008), en su instituto del CNR en Pisa (Italia) realizaron un estudio de la presencia de fitoquelatinas en algas marinas (Thalassiosira weissflogii, Skeletonema costatum, Phaeodactylum tricornutum) expuestas a metales liberados de sedimentos contaminados. Estos autores confirmaron que la respuesta de las algas ante estos elutriatos era específica para cada taxón, y que el cadmio provocaba una mayor respuesta, en cuanto a la producción de fitoquelatinas, que el cobre y el carbono orgánico total presente. Dewez y colaboradores (2005), de la Universidad de Québec (Canadá), en una publicación conjunta con investigadores de la Universidad de Reims (Francia), compararon la sensibilidad de biomarcadores fotosintéticos (mediante el uso de un PAM) frente a la de biomarcadores enzimáticos y moleculares, tales como las citadas SOD, CAT, ascorbato peroxidasa (APX), glutatión reductasa (GR), y glutatión S-transferasa (GST), sobre una población de Scenedesmus obliquus (que, como se ha citado, es una especie dulceacuícola). Como tóxicos tipo utilizaron cobre y fludioxinil (un fungicida). En estos experimentos son precisas altas concentraciones de los tóxicos empleados para producir algún efecto sobre las poblaciones algales (entre 2 y 3 mg L-1 de Cu, por ejemplo, que son valores uno o dos órdenes de magnitud por encima de la mayor parte de los valores de EC50%72h referidos a la biomasa para microalgas marinas. Estos elevados valores pueden explicarse por las altas densidades celulares utilizadas en los experimentos, las cuales, como se ha demostrado, disminuyen la

sensibilidad de los ensayos (Moreno-Garrido et al., 2000). La relevancia ecológica de estos experimentos podría incrementarse en gran manera utilizando densidades celulares menores y mayores volúmenes para obtener la biomasa necesaria para llevar a cabo los análisis requeridos.

La citometría de flujo es una herramienta que puede ser muy importante en el estudio de

biomarcadores no fotosintéticos en microalgas. Además de su uso como herramienta de

análisis de los pigmentos fotosintéticos de las células microalgales expuestas a potenciales situaciones de estrés tóxico (Dewez et al., 2008), el uso de otros fluorocromos está ampliando el ámbito de aplicación de de esta técnica. El diacetato de fluoresceína ha sido usado como biomarcador vital de las células microalgales por Stauber et al. (2002), investigadores del CSIRO en Bangor, Australia. Recientes estudios llevado a cabo en el Departamento de Microbiología de la Facultad de Biología de la Universidad Complutense de Madrid demuestran también la capacidad de ciertos fluorocromos, tales como el IP (Iodine Propidium) como marcadores de actividad metabólica general en las células, en este caso protozoos (Gallego et al., 2007).

Existen evidencias de que los metales inducen estrés oxidativo en algas (Pinto et al., 2003), y otros microorganismos (Rico et al., 2009). Consecuentemente, los niveles de las moléculas reactivas del oxígeno (ROS) pueden utilizarse como biomarcadores de estrés producido por metales (Rico et al., 2009). La di-hidro-rodamina 123 (Rh123) es un fluorocromo adecuado para detectar dichas ROS, ya que cuando se oxida resulta en rodamina 123, una sustancia fluorescente que se acumula en las mitocondrias (Gallego et al., 2007). La solicitud de un citómetro de flujo dentro del proyecto que se presenta se justifica por la adecuación de dicha técnica analítica a los objetivos del proyecto, por la experiencia acumulada por los investigadores en el uso de estas técnicas (Corzo et al., 2005; Debelius 2008; Debelius et al., 2008) y por lo obsoleto del equipamiento actual perteneciente al grupo (el equipo de citometría de flujo del departamento cuenta ya con más de diez años de uso).

Existe una revisión reciente sobre los trabajos realizados en biomarcadores bioquímicos en algas (Torres et al., 2008), que resume la información existente hasta la fecha e indica posibles líneas de actuación en el futuro, apuntando la adecuación de estos organismos como potenciales monitorizadotes de la calidad ambiental en el medio marino. La práctica de los ensayos de toxicidad sobre microorganismos fotosintéticos marinos requiere una alta especialización de los operadores, lo que dificulta la propagación de dichos ensayos como prácticas rutinarias de medida de la calidad ambiental. El proyecto contempla, asimismo, el desarrollo y posible patente de un set de medida de toxicidad comercializable, enfocado a la detección de biomarcadores moleculares de estrés. El diseño de este set de medida tenderá a la sencillez de uso con objeto de facilitar su aplicación por parte de personas no familiarizadas con el cultivo y manejo de poblaciones microalgales marinas.

Hasta donde sabemos, no hay grupos españoles trabajando en biomarcadores de estrés tóxico en microalgas marinas. Dada la importancia de las investigaciones propuestas, los resultados de las mismas aseguran su publicación en revistas internacionales de alto índice de impacto.

El grupo solicitante es pionero en el diseño de ensayos de toxicidad sobre microalgas en

ambientes marinos, costeros y estuáricos (Araújo et al., 2008; Hampel et al., 2001; Moreira dos Santos et al., 2002; Moreno-Garrido & Cañavate, 2001; Moreno-Garrido et al., 1999, 2000, 2001, 2003a, 2003b, 2003c, 2005, 2006, 2007), así como en la realización de bioensayos de toxicidad en estos ambientes sobre otros tipos de organismos, muchos de los cuales han centrado su atención en el estudio de biomarcadores de estrés tóxico (Viarengo et al., 1998, 1999; Cajaraville et al., 2000;; Mazorra et al., 2002; Campana et al., 2003; Solé et al., 2004, 2009; Martín-Díaz et al, 2007, 2008a, 2008b; Quirós et al., 2007; Kalman et al., 2008; Romero-Ruiz et a l., 2008). El grupo cuenta con una amplia experiencia en el manejo de microalgas marinas, y uno de los miembros del grupo solicitante es responsable de la conservación de la Colección de Cepas de Microalgas Marinas del Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía, colección incluida en el BIOCISE y que cuenta en la actualidad con más de un centenar de cepas microalgales en cultivo (Lubián & Yúfera, 1989).

OBJETIVOS DEL PROYECTO

El proyecto presentado se justifica por a) la necesidad creciente de contar con herramientas válidas para la monitorización de ecosistemas costeros potencialmente sujetos a procesos de contaminación y b) la escasa bibliografía referente al uso de biomarcadores de toxicidad en poblaciones de microalgas marinas, costeras y estuáricas. La importancia de estos microorganismos en las redes tróficas pelágicas, costeras y estuáricas, que se sustentan en ellas, supone un valor añadido al estudio de las respuestas de las microalgas ante procesos de contaminación.

La hipótesis de partida planteada es que las microalgas marinas, ante situaciones de estrés tóxico, producen respuestas moleculares y enzimáticas que pueden ser utilizados como biomarcadores de contaminación en sistemas de alerta precoz para la monitorización de ecosistemas marinos, estuáricos y costeros.

El Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía cuenta con la infraestructura y el capital humano (con gran experiencia acumulada en estudios de toxicidad sobre microalgas marinas y en bioensayos con biomarcadores de toxicidad) necesario para llevar a cabo las investigaciones propuestas.

Antecedentes y resultados previos

La mayor parte de las escasas publicaciones referentes a biomarcadores de estrés tóxico sobre microalgas se ha centrado, sobre todo, en especies dulceacuícolas. Existen estudios en la bibliografía sobre las alteraciones de actividades enzimáticas SOD, CAT, APX, GR y GST sobre Scenedesmus obliquus ante la presencia de un metal (Cu) y un fungicida, así como de las respuestas del enzima SOD sobre poblaciones de la misma especie, provocadas por la  presencia de pesticidas. En agua de mar, tan sólo hay referencias sobre la variación de los niveles de SOD, CAT y GPX en poblaciones de Pavlova viridis expuesta a diferentes metales. Por otra parte, estudios aún más recientes se centran en la detección de los niveles de fitoquelatinas producidos por tres especies microalgales marinas también ante la presencia de metales. La citometría de flujo puede utilizarse para determinar biomarcadores de estrés tóxico, mediante el uso de fluorocromos adecuados. Estas técnicas aún no se ha utilizado sobre microalgas marinas o dulceacuícolas. En cualquier caso, ninguna de estas técnicas se ha utilizado, hasta la fecha, sobre poblaciones microalgales naturales. El grupo de investigación solicitante cuenta con una amplia experiencia en el manejo de poblaciones microalgales marinas. Se trata de un grupo que ha publicado trabajos de referencia en el campo del diseño

de ensayos de toxicidad para ambientes marinos, costeros y estuáricos, con especial

incidencia en el campo de las microalgas (ver currículum del grupo solicitante). En estos trabajos, entre otros muchos resultados, se constató la importancia de la densidad celular en los ensayos de toxicidad tipo “batch”, se calcularon valores de EC50 para diferentes especies microalgales y distintos tóxicos tipo, se diseñaron los primeros ensayos de toxicidad in situ para microalgas marinas, se diseñaron por primera vez bioensayos de toxicidad sobre microalgas bentónicas directamente expuestas a sedimentos experimentales y naturales, y se efectuaron estudios de citometría de flujo sobre poblaciones microalgales, en estudios in vitro tanto como en estudios de campo.

El Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía cuenta, además, con una de las colecciones más completas de microalgas marinas del territorio español, lo que permite ensayar un alto número de especies pertenecientes a grupos taxonómicos muy diversos.

Objetivos concretos

1. Establecimento de las EC505b72h (concentraciones efectivas 50% en relación con la biomasa a las 72 horas) para especies microalgales utilizadas habitualmente en ensayos de toxicidad en medios marinos y para cada uno de los contaminantes-tipo.

2. Diseño y optimización de los distintos protocolos de detección y medida de las proteínas y péptidos biomarcadores seleccionados (glutatión, fitoquelatinas, HSPs), de los niveles de actividad enzimática (CAT, SOD, GPX, GR, y APX) y de las especies reactivas del oxígeno (ROS), aplicados a poblaciones experimentales de microalgas sujetas a estrés tóxico por metales, herbicidas y productos antifouling. La mayor parte de estos protocolos no se han aplicado nunca sobre microalgas marinas.

3. Realización de un screening de actividad de los biomarcadores seleccionados por su mejor adecuación al objetivo general del proyecto (detección precoz de procesos de toxicidad) sobre especies microalgales de diferentes clases taxonómicas, expuestas a

concentraciones subletales de las especies químicas seleccionadas. Tal información está ausente de la bibliografía actual.

4. Validación de las técnicas desarrolladas sobre poblaciones mixtas naturales, recolectadas en ambientes marinos, costeros, estuáricos, así como aplicación de los bioensayos mediante la exposición de poblaciones microalgales de laboratorio a agua recolectada en diversas localizaciones. Se diseña este objetivo para incrementar la relevancia ecológica de los ensayos propuestos.

5. Desarrollo de un set de medida de toxicidad basado en biomarcadores y microalgas

marinas, susceptible de ser patentado, comercializado y aplicado sobre muestras marinas, costeras, estuáricas y en agua intersticial de sedimentos marinos.

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BENEFICIOS DEL PROYECTO

1.- Publicación de los resultados en revistas internacionales, recogidas en el SCI entre las principales de este campo: Biomarker, Environmental Health Perspectives, Environmental Science and Technology, Chemosphere, Environmental Internacional, Water Research, Marine Environment Research o Environmental Toxicology and Chemistry.

2.- Difusión de los resultados en congresos internacionales (SETAC, CICTA, PRIMO), con el fin de dar a conocer de manera rápida los resultados preliminares más sobresalientes, y facilitar la comunicación con otros grupos internacionales.

3.- La explotación de los resultados obtenidos puede dar lugar a la formalización de contratos o convenios de investigación con empresas de gestión medioambiental.

4.- La investigación propuesta podría incluir la dirección de una tesis doctoral, en caso de que fuera asociada a este proyecto una beca del Plan de Formación.

5.- Creación de una página WEB con los resultados obtenidos gracias al proyecto, que permita una divulgación de los resultados no sólo accesible a investigadores sino a también al resto de la sociedad.

6.- Posibilidad de establecimiento de una patente para un “set” de medida de toxicidad de agua marina, costera, estuárica o intersticial de sedimentos marinos, basado en respuestas de biomarcadores de toxicidad y microalgas.